Оценете
(0 гласа)

  обратно в категорията    

Добавки към електрофоретичните буфери - сърфактанти 

     При повечето електрофоретични подходи разтворът, покриващ гелната матрица, освен буферирашите соли съдържа и една или повече допълнителни субстанции. Функцията на тези вещества е да модифицират свойствата на изследваните молекули и обикновено се отнасят към една от следните три групи: влияещи на водородните връзки съединения, сърфактанти и редуциращи агенти.

     При електрофоретичното разделяне на протеини разтварянето на пробата е начална стъпка с критично значение. Това е особено важно в случаите, когато има силно изразени неполярни взаимодействия. В миналото за тази цел широко се е използвала уреата, но днес изследователите предпочитат нейоногенни, анионни или катионни детергенти.

     Нейоногенните детергенти (Tween-20, Triton X-100) са принципно по-слабо денатуриращи от анионните и катионните детергенти. Нейоногенните детергенти позволяват запазването на ензимните активности и някои фини имунологични свойства, които биха били унищожени от йоногенните детергенти. Обикновено Tween-20 или Triton X-100 се добавят в умерени количества (0.1%) към гелния буфер. Тези субстанции може да се използват и в 1% концентрация за предварително третиране на пробите.

                                               Triton X-100        Tween-20

     Основният недостатък на нейоногенните сърфактанти е, че не продуцират проследимо съотношение заряд/маса в молекулите от пробата. Следователно с използване на такива сърфактанти не може да се определи молекулната маса на протеините с едно пускане на електрофореза и по принцип получените по този начин електрофоретични резултати се интерпретират по-трудно от резултатите от експерименти, проведени в присъствието на заредени сърфактанти (напр. натриев додецилсулфат).

                                                                       SDS

     При белтъчната електрофореза като сърфактант най-често се използва натриев додецил сулфат (SDS, анионен детергент). При третирането им с SDS белтъците напълно се покриват с додецил сулфатните аниони и преминават в разтегната конформация. Броят свързани аниони е много голям, приблизително равен на половината на броя на аминокиселинните остатъци в белтъка. В резултат собственият заряд на протеина е незначителен и основно значение има придобитият под действието на SDS заряд. Така дори протеини с много различаваща се структура имат фактически еднакво съотношение заряд към маса. При електрофореза такива молекули се разделят само по молекулно тегло. 

     Сравнително рядко се налага използването на катионни детергенти като цетилтриметиламониев бромид (CTAB). Обикновено се прилага, когато пробите не могат да бъдат разделени посредством SDS-PAGE. Това обикновено се получава при силно алкални или силни киселинни проби. Под действие на големия отрицателен заряд силно киселинните проби се свързват слабо с натриевия додецил сулфат. При силно алкалните проби добавянето на натриев додецилсулфат може да доведе до преципитация. Използването на CTAB има същите предимства като използването на SDS (т.е. разделяне само по молекулна маса), но трябва да се направят нужните настройки на самия електрофоретичен апарат, за да може пробите да мигрират към отрицателния полюс. 

 Свързани реагенти: