Оценете
(0 гласа)

  обратно в категорията    

Матрици за гелна електрофореза - полиакриламид     

     Матрицата при гелната електрофореза представлява твърда среда, която фиксира пробите и позволява детекция при постелектрофоретичния анализ. Освен това тя кара компонентрите на дадена проба да се разделят на база на техния размер докато се движат през порьозната ѝ структура. Матрицата оказва по-голямо съпротивление на движението на по-големите молекули. Допълнителните функции на матрицата са редукция на конвекционните потоци и предотвратяване на дифузиране на пробите, подпомага запазването на рязко изразените граници на ивичките на отделните компоненти на пробата. 

     Матрицата, която използвате, трябва да е химически инертна по време на електрофорезата. Трябва да бъде лесна за подготовка и модификация. Най-често се използва полиакриламид и агароза. Тези вещества съответсвтат на гореописаните свойства, като всяко от двете има своите предимства при конкретни приложения.

                                                       

      Полиакриламидният гел се формира от полимеризацията на акриламид във воден разтвор в присъствието на малки количества бифункционален омрежител. Омрежителят най-често е метилен:бисакриламид (често обозначаван като bis или MBA). Кополимеризацията на акриамида с метилен бисакриламид продуцира триизмеран мрежа. Съществуват и други омрежители – пиперазин диакрилат, N, N'- бисакрилцистамин, N,N'-диалилтартардиамид. Пиперазин диакрилатът се използва за редуциране на сребърния фон при SDS-PAGE. Другите два омрежителя могат да бъдат разкъсани, което прави гела разтворим.

                                    

     За улеснение е въведена стандартна номенклатура за състава на полиакриламидните гелове. В тази номенклатура T представлява общата концентрация (w/v) на мономера (акриламид плюс омрежител) в гела, а С – процента омрежител от общия мономер. Например при 8% 19:1 акриамид:бисакриламиден гел има стойност Т=8% и стойност С=5%. 

     При внасянето на катализатор в системата полимеризацията на акриламид и метилен бисакриламид протича по свободно радикален механизъм. Най-често се генерират свободни кислородни радикали от амониев персулфат в присъствието на третични алифатни амини N,N,N',N'-тетраметилендиамин (ТЕМЕД). Друга каталитична система включва генерирането на свободни радикали при фотохимична реакция на малки количества рибофлавин в присъствието на ТЕМЕД. И при двете каталитични системи излишните количества кислород биха инхибирали удължаването на полимерните вериги и като резултат биха се получили вериги с по-малка средна дължина. Тези ефекти може да се преодолеят чрез деариране под вакуум на магнитна бъркалка преди поставянето на катализатора. 

     За определени приложения полиакриламидът има предимущества пред агарозата. При агарозата порите са големи, поради което агарозният гел не действа като молекулно сито за малките ДНК фрагменти и при повечето протеини. Допълнително чрез промени в общата концентрация мономер в гела и на съотношението между акриамида и бисакриламида може да променя размера на порите в гела, като всеки път при дадени концентрации и съотношения този размер на порите ще е един и същ. Малкият размер на порите и повторяемостта на този размер води до много по-голяма разделителна способност: може да се детектира 0.1% разлика в размера (1 база при 1 к.б. молекула). Тъй като акриламидът и бисакриламидът са синтетични химикали, то няма разлика между различните им партиди. При най-висококачествените агарози (напр. AquaPor) също няма разлики между различните партиди. 

     При полиакриламидните гелове размерът на порите се регулира чрез промени в Т и С стойностите. При повишаване на Т намалява размерът на порите в линейна зависимост. По-концентрираните гелове (по-високо Т) с малки пори се използват да разделяне на малки молекули. Зависимостта между размера на порите и С-стойността е по-сложна. Като правило порите са най-малки при С=5% (т.е. 19:1 гел). Понижаването на С води до по-големи пори, тъй като намалява броя на молекулите омрежител. Повишаването на С над 5% също води до увеличаване размера на порите поради нехомогенно пакетиране на веригите в гела.   

     За повечето случаи на денатурираща ДНК и РНК електрофореза се използва 5% С стойност (19:1 гел), а за нативните ДНК и РНК гелове – 3.3% (29:1). За SDS-PAGE белтъчна електрофореза най-често се използва 2,6% (37.5:1). По-долу може да видите приложенията на различните съотношения акриламид/бис и гелни концентрации. Препоръчителните приложения на дадено съотношение са обозначени чрез удебеляване на молекулните размери:

 

Акриламид:бис

Гел %

Нативна ЕФ
ДНА/РНК (bp)

Денатурираща ЕФ
DNA/RNA (bp)

Протеин (kp)

19:1

4

100-1500

70-500

100-200

"

6

60-600

40-400

40-150

"

8

40-500

20-200

20-100

"

10

30-300

15-150

15-70

"

12

20-150

10-100

8-60

29:1

5

200-2000

70-800

>150

"

6

80-800

50-500

50-200

"

8

60-400

30-300

30-125

"

10

50-300

20-200

20-100

"

12

40-200

15-125

10-70

"

20

<40

<40

<30

37.5:1

6

--

--

60-200

"

8

--

--

50-150

"

10

--

--

25-100

"

12

--

--

15-80

  

 Свързани реагенти: