Оценете
(0 гласа)

  обратно в категорията    

Основи на електрофорезата - значение на структурата на протеините за поведението им при електрофореза

     Техниките за разделяне на смес от биологични субстанции имат водещо значение за всеки научно-изследователски експеримент. Съществуват разнообразни такива техники, които се базират на разликите в химичните свойства, биологичните свойства, заряда и размера на разделяните молекули от дадена проба с биологичен произход. При работа с нуклеинови киселини или протеини и при малък обем на пробите най-предпочитан метод е гелната електрофореза (ЕФ). Високата ѝ резолюция и чувствителност я прави универсален метод в молекулярната биология, биохимията и биологията като цяло. 

     На най-фундаментално ниво гелната ЕФ представлява прилагане на електрично поле върху смес от биомолекули, което поле ги кара да мигрират през матрица или гел. При повечето електрофоретични техники разделянето се базира на молекулните размери - по-големите молекули се движат по трудно през гела. Пробата се разделя на отделни ивици според подвижността на молекулите в гела. След приключване на разделянето геловете се подлагат на обработка за визуализиране на получените ивици, което от своя страна осигурява разнообразна аналитична информация. Съществуват и техники за екстракция и пречистване на нуклеиновите киселини или протеини от отделните ивички. За да се разбере поведението на биомолекулите при ЕФ е необходимо да се познава добре структурата им.

Протеини 

     Протеините са полимери с повтяряща се мономерна единица, наречена аминокиселина. Аминокиселините се състоят от централен въглероден атом, който носи амино група, карбоксилна група, водороден атом и странична верига. Аминокиселините се различават по свойствата на страничните си вериги.

                                                    

     Едноверижните протеини обикновено се състоят от 50 до 1000 аминокиселинни остатъка. Биолозите различават първична, вторична, третична и четвъртична структура на протеините. Първичната структура е реалната последователност на аминокиселините във веригата му. Вторичната структура се определя от локални огъвания, кинкове и спирали, а третичната обозначава пространствената форма на полипептидната верига. Четвъртината структура се използва за описание на протеини, състоящи се от повече от една полипептидна верига.

                                                             структура на протеините белтъците 

     Степента на йонизация на даден протеин зависи от природадата на аминокиселините в средата му и средата, в която се намира. В неутрални водни разтвори (рН = 7) протеин с преобладаващи основни аминокиселини (лизин, аргинин, хистидин) би бил с положителен електрически заряд: 

                                                               положително зареден протеин

     И обратното, протеин с високо съдържание на аминокиселини с киселинни свойства (глутаминова и аспаргинова киселина)са с цялостен отрицателен заряд при неутрални условия.

                                                              отрицателно зареден протеин

 

     Тъй като степента на йонизация зависи от рН на средата, почти всички протеини, поставени в алкална среда, натрупват отрицателен заряд поради загуба на водородни катиони в резултат на киселинно-алкалното равновесие. Протеин, поставен в киселинна среда, обикновено е положително зареден. Неденатуриращата (нативна) протеинова електродореза обикновено се провежда в слабо алкална среда, в която повечето протеини придобиват отрицателен заряд и мигрират към положителния полюс. При денатуриращата протеинова електрофореса в присъствието на натриев додецил сулфат протеините също носят отрицателен заряд поради емулгиране с отрицателно заредените йони на натриевия додецил сулфат (за повече информация вижте и статията „Добавки към буферите - сърфактанти“).

                                                               SDS protein electrophoresis

     рН, при което даден протеин е неутрален по заряд, е функция на типа и броя на йонизируемите групи в протеина. При такова pH, наричано изоелектична точка (pI), протеинът не се движи под влияние на електрично поле. Тъй като броят и видът на тези групи при различните протеини е различен, изоелектричната точка на различните протеини е различна. Това различие се използва за изоелектрично разделяне посредством изоелектрично фокусиране :

                                                           protein

 Свързани реагенти: