Оценете
(0 гласа)

  обратно в категорията    

Основи на електрофорезата - значение на структурата на нуклеиновите киселини за поведението им при електрофореза

     Техниките за разделяне на смес от биологични субстанции имат водещо значение за всеки научно-изследователски експеримент. Съществуват разнообразни такива техники, които се базират на разликите в химичните свойства, биологичните свойства, заряда и размера на разделяните молекули от дадена проба с биологичен произход. При работа с нуклеинови киселини или протеини и при малък обем на пробите най-предпочитан метод е гелната електрофореза (ЕФ). Високата ѝ резолюция и чувствителност я прави универсален метод в молекулярната биология, биохимията и биологията като цяло. 

     На най-фундаментално ниво гелната ЕФ представлява прилагане на електрично поле върху смес от биомолекули, което поле ги кара да мигрират през матрица или гел. При повечето електрофоретични техники разделянето се базира на молекулните размери - по-големите молекули се движат по трудно през гела. Пробата се разделя на отделни ивици според подвижността на молекулите в гела. След приключване на разделянето геловете се подлагат на обработка за визуализиране на получените ивици, което от своя страна осигурява разнообразна аналитична информация. Съществуват и техники за екстракция и пречистване на нуклеиновите киселини или протеини от отделните ивички. За да се разбере поведението на биомолекулите при ЕФ е необходимо да се познава добре структурата им. 

Нуклеинови киселини (НК) 

DNA nucleotide ДНК нуклеотид      рнк Както много от биологичните молекули нуклеиновите киселини (наричани за краткост НК) са полимери - дълги молекули, изградени от повтарящи се единици. При НК повтарящите се единици се наричат нуклеотиди. Всеки нуклеотид се състои от пентоза, азот съдържаща база и фосфатна група. Двете основни категории НК – дезоксирибонуклеинови киселини (ДНК) и рибонуклеинови киселини (РНК) – се различават по захарния пръстен и по набора от четирите бази, които влизат в състава на нуклеотидите.  

      За електрофорезата водещо значение има йонизирането на фосфатните rna nucleotide рнк нуклеотидгрупи на нуклеотидите, което придава отрицателен заряд на нуклеиновите киселини. Тъй като всички нуклеотиди имат еднакъв зарад, то съотношението заряд към маса на различните НК е почти идентично. Под въздействие на електричното поле нуклеиновите киселини мигрират към положителния полюс. 

 

                                           adenine аденинguanin гуанинthymine Cytosine Uracil 

     ДНК и РНК съдържат набот от четири различни нуклеотида, които съответстват на четири бази (за ДНК - аденин, гуанин, тимин, цитозин; за РНК – аденин, гуанин, урацил, цитозин). Всяка база се свързва с определена база от оставащите три на база на симетрия на водородни връзки – аденин с тимин в ДНК (или урацил в РНК), гуанин с цитозин. Това свързване между базите често се нарича сдвояване и благодарение на него Днк и РНК може да съществуват като в едно- или двуверижна форма. Двуверижната форма се състои от две комплементарни вериги, свързани посредством сдвоянане между базите.

                                                       

     Електрофорезата на двойноверижна ДНК или РНК се обозначава като нативна електрофореза. Електрофорезата на едноверижна ДНК/РНК протича при денатуриращи условия. За химическата денатурация най-често се използва с формамид и уреа. Тези съединения водородните връзки между азотните бази. Обикновено се прилага комбинация от формамид, уреа и нагряване от пробоподготовката до пускането на гела. Денатуриращите условия подсигуряват едноверижност и предотвратяват конформационни промени, дължащи се на сдвояване. Денатуриращата електрофореза осигурява постоянството на връзка между молекулния размер и движението през гела. 

                                                              уреа формамид